Minggu, 14 April 2013

Analisis DNA Hasil Isolasi Dengan Spektofotometri


I.                   Judul
 Analisis DNA Hasil Isolasi Dengan Spektofotometri

II.                Tujuan
Agar dapat melakukan analisis kuantitatif atau kualitatif DNA mamalia hasil isolasi

III.             Latar belakang
Pembelajaran tentang genetika molekuler memegang peranan dalam  mengidentifikasi faktor genetik yang mempengaruhi kerentanan penyakit manusia dan hasilnya. Kemajuan teknik dalam genotip dan analisis sekuen, bersamaan dengan ketersediaan sekuen dan informasi variasi sekuen yang terbatas telah meningkatkan substansial lingkup manusia terhadap penelitian genetik. Salah satu pengembangan teknologi yang penting untuk mendapatkan genotip dengan hasil yang baik adalah kuantifikasi DNA. Keakuratan dan kuantifikasi DNA yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan hasil genotip yang efisien. Sampai saat ini, spektrofotometri telah menjadi metode tradisional untuk kuantifikasi DNA dalam biologi molekuler(1).
Seiring makin bertambahnya pengetahuan kita tentang biologi molekular, semakin menjadi jelas bahwa perkembangan dan pemanfaatan dalam bidang ini menimbulkan revolusi yang besar dalam diagnosis, pencegahan dan pengobatan penyakit. Pemeriksaan untuk variasi urutan DNA lebih sensitif dibandingkan dengan banyak teknik lain (seperti pemeriksaan enzim) dan memungkinkan kita mengenal penyakit lebih dini dan, oleh karena itu, kemungkinan besar mengenal stadium yang lebih dapat diterapi. Pemeriksaan DNA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi pembawa penyakit yang diwariskan sehingga pembawa dapat menerima penyuluhan yang sesuai. Karena variasi genetic sedemikian khusus, “sidik jari” DNA (analisis perbedaan urutan DNA) dapat digunakan untuk menentukan hubungan keluarga atau untuk membantu mengidentifikasi pelaku kejahatan(2).
Penghitungan asam nukleat sangat penting sebagai prosedur dalam banyak penelitian biologi molekuler. Namun, penentuan konsentrasi DNA atau RNA yang akurat bisa menjadi sulit, terutama ketika kemurnian sampel tidak pasti. Di banyak kasus, pendekatan yang paling cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi asam nukleat yang relatif murni dan protein adalah dengan membaca absorbansi pada spektrofotometri. Jumlah cahaya yang diserap oleh sampel berbanding lurus dengan konsentrasi protein dan / atau asam nukleat dalam sampel. Konversi absorbansi dalam pembacaan konsentrasi didasarkan pada hukum Lambert-Beer(3).
                        Spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi(4).
                        Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik, baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar(5).
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan / jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat(6).
Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260 / OD280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml(7).
Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk mengetahui dimana terjadi absorpsi maksimum dan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar(8).
Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA / RNA menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm(9,10).


IV.             Metode

A.    Bahan dan Alat
Alat : 1. Spektrofotometri UV
         2. Bluetip
         3. Yellowtip
         4. Mikropipet
         5. Kuvet
         6. Gelas Beaker
         7. Erlenmayer

Bahan : 1. DNA hasil isolasi
              2. Aquadest steril


B.     Cara Kerja

Dipipet 5 µl sampel DNA hasil isolasi, ditambahkan aquadest secukupnya sehingga volume akhir 1 ml

Dicampur, kemudian pindahkan kedalam kuvet spektrofotometer
 

Blanko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquadest
 

Dibaca absorbansi sampel dengan spektorfotometer pada λ260 nm
Lakukan pembacaan yang ke-2 pada λ280 nm

Tentukan rasio absorbansi yang ke-2 pada λ260 nm dan λ280 nm
 

Dihitung konsentrasi DNA untai sampel dan tentukan konsentrasi DNA yang diperoleh


Cara kerja alat spektrofotometri

Pilih spektrofotometri
 

Set λ dengan menekan tombol go to WL dan atur λ260 nm

Tekan tombol auto zero sampai muncul nilai absorbansi pada LCD menjadi 0,000

Baca absorbansi blamko (blanko)

Tekan tombol star/stop

Catat nilai absorbansi
 

Ganti isi kuvet dengan larutan uji DNA

V.                Hasil dan Pembahasan

Hasil dan Perhitungan

Uji
λ260
λ280
Blanko
0,0914
0,088
Sampel
0,1040
0,070

                
Δ λ260 = sampel – blanko
= 0,1040 – 0,0914
= 0,0126

Δ λ280 = sampel – blanko
= 0,088 – 0,070
= 0,018

Konsentrasi DNA (µg/ml) = 0,0126 X 200 X 50 µG/ML / 1000
       = 0,126 µG/ml

Δ λ260/  λ280 = 0,0126 / 0,018
= 0,7

Kurang dari 1,8 berarti banyak pengotor fenol dan protein

Pembahasan

Percobaan ini bertujuan untuk melakukan analisis kuantitatif atau kualitatif DNA mamalia dari hasil isolasi. Hasil isolasi yang telah didapatkan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV. DNA dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV karena memiliki ikatan rangkap terkonjugasi.
Analisis spektroskopi adalah analisis yang didasarkan pada interaksi radiasi dengan spesies kimia. Interaksi radiasi dengan spesies kimia dapat berupa refleksi, refraksi atau difraksi. Cara interaksi dapat berupa absorpsi, pemendaran, emisi, penghamburan tergantung pada jenis materi. Range panjang gelombang radiasi UV-tampak berada antara 200 nm-800 nm, terdiri dari daerah UV (200 nm-400 nm) dan daerah tampak (400 nm-700 nm). Jika suatu berkas elektromagnetik dilewatkan pada suatu sampel kimia, maka sebagian gelombang dapat terabsorpsi. Energi elektromagnetik yang diabsorpsi tersebut ditransfer ke atom atau molekul sehingga dapat terjadi promosi energi partikel ke tingkat yang lebih tinggi, atau disebut tingkat eksitasi. Frekuensi absorpsi dapat terukur dan menghasilkan spectra(4)
Panjang gelombang saat sampel memiliki absorbansi maksimal disebut dengan λ maksimal. Panjang gelombang (λ) maksimal spesifik untuk setiap sampel, dan panjang gelombang ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Untuk analisis kuantitatif, absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang maksimal sampel tersebut untuk mengurangi adanya interferensi serapan oleh molekul/zat lain dalam suatu sampel(4)
Analisis kuantitatif DNA dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan / jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat.
DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein menyerap kuat pada 180 nm. Namun, asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm (50%-55% dari absorbansi poada 260 nm), dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm (absrobansi bervariasi, tergantung pada protein). Dengan demikian, untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA dan protein dalam campuran yang kompleks bisa menjadi sulit. Namun, mengukur absorbansi pada 260 nm dan pada 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam nukleat: rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk DNA atau 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah menunjukkan adanya protein atau kontaminan lainnya(3).
 Absorbansi spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bias dibedakan dari DNA. Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk mengukur DNA saja dalam sampel. Dalam jurnal yang ditemukan, masalah tersebut dapat diatasi dengan menambahkan suatu senyawa  berfluoresensi, yaitu DNA quant 200(3).
        Untuk preparasi sampel Dipipet 5 µl sampel DNA hasil isolasi, ditambahkan aquadest secukupnya sehingga volume akhir 1 ml dicampur, kemudian pindahkan kedalam kuvet spektrofotometer, Blanko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 ml aquadest dibaca absorbansi sampel dengan spektorfotometer pada λ260 nm dan dilakukan pembacaan yang ke-2 pada λ280 nm.
Pada percobaan yang kami lakukan rasio yang didapat adalah 0,7, rasio ini kurang dari 1,8 yang berarti bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8, apabila rasio kurang dari 1,8 menunjukan adanya pengotor protein atau fenol, sedangkan apabila rasionya lebih dari 1,8 menunjukan adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm. Konsentrasi DNA yang kami dapatkan pada percobaan ini adalah 0, 126 µg/ml. Metode pemurnian sampel (DNA) secara kimiawi yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate).

VI.             Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum ini adalah mahasiswa telah dapat melakukan analisis kuantitatif/kualitatif DNA mamalia hasil isolasi. DNA dapat dideteksi dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm. DNA yang kami isolasi masih terdapat banyak pengotor protein atau fenol, hal ini dapat dilihat dari rasio yang didapat yaitu 0,7, rasio ini kurang dari 1,8. Konsentrasi DNA yang didapat pada hasil isolasi adalah 0,126 µg/ml.

VII.          Daftar Pustaka
1.      Haque, K.A. et al. Performance of High-throughput DNA Quantification Methods. Biomed Central. 2003;3(20):2
2.      Dawn,B.M., Allan, D.M., Colleen,M.S., 2000, Biokimia Kedokteran Dasar Pendekatan Klinis, EGC Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta, 235.
3.      Teare, J.M. et al. Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171.
4.      Day, R.A. Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi 6, Penerbit Erlangga, Jakarta, 391.
5.      Riyadi, 2009, Macam spektrofotometri dan perbedaannya (uv. Vis dan ir), Penerbit Erlangga, Jakarta.
6.      Braun, R. D., 1982, Introduction to Chemical Analysis, New York : McGraw-Hill  Book, New York.
7.      Harjadi, W., 1986,  Ilmu Kimia Analitik Dasar , Penerbit Gramedia, Jakarta.
8.      Suharsono dan Widyastuti, U., 2006, Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen, Pusat Penelitian  Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB  dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor.
9.      Rohman, Abdul., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
10.  Sahasrabudhe, A., Deodhar, M., 2010, Standartization of DNA Extraction and Optimization of RAPD – PCR Condition in Garcinia Indica, International journal of botany, Vol.6, No.3 : 294, Mumbai, India.
11.  Hasan, Z. dkk, 2008, Efficient method for the extraction of genomic DNA from wormwood (Artemisia capillaris), African Journal of Biotechnology Vol. 7, No.18 : 3213, Mengabang Telipot, KualaTerengganu, Malaysia.  

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar