Pengambilan Spesimen dan Isolasi DNA Mamalia

I.        Judul

Pengambilan Spesimen dan Isolasi DNA Mamalia

II.      Tujuan

Dapat mengetahui jenis specimen dan dapat mengisolasi DNA

III.      Latar Belakang

DNA merupakan salah satu makromolekul yang mempunyai peranan sangat penting pada jasad hidup. DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetic yang diturunkan kepada jasad keturunannya⁽¹⁾.

Struktur DNA tersususn oleh dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (antipararel), rantai yang satunya mempunyai orientasi 5’     3’, sedangkan rantai yang lain berorentasi 3’   5’. Kedua ikatan tersebut berikatan dengan adanya ikatan hydrogen antara basa adenine (A) dengan thymine (T), dan antara guanine (G) dengan cytosine (C). ikatan antara A-T berupa dua ikatan hydrogen, sedangkan antara G-C berupa tiga ikatan hydrogen sehingg ikatan G-C lebih kuat⁽¹⁾. Untai terpendek DNA paling dekat dengan 5’ ⁽²⁾.

Isolasi DNA dari sampel biologis merupakan langkah penting dalam proses tes biologi molekular berbasis DNA. DNA yang diekstraksi dari jaringan tanaman atau hewan atau dari bakteri, harus murni atau bebas dari kontaminan (protein, karbohidrat) untuk digunakan dalam berbagai aplikasi dalam biologi molekular termasuk PCR, genotip, sekuensing DNA, dll ⁽³⁾.

DNA, RNA, dan protein dapat diisolasi dari bahan biologis seperti jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel lainnya⁽⁴⁾. Metode - metode yang dapat digunakan dalam isolasi DNA antara lain :

1.    Saturated salt

2.    Fenol kloroform / ekstraksi pelarut organik (Guanidin Isothiosianat). Prinsip metode ini yaitu pelarut organic akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein sehingga fase air yang akan terpisah mengandung DNA. Larutan disentrifugasi untuk mengendapkan protein sehingga larutan yang berada pada lapisan atas mengandung DNA dapat diambil dan dianalisis. Metode ini memakan waktu lebih lama  dan metode ini bergantung pada pemisahan fase campuran air dan larutan yang mengandung fenol, kloroform dengan melalui sentrifugasi

3.    Metode salting out

Dimulai dengan lisis membran sel. Salting out merupakan teknik konvensional dimana protein dan kontaminan yang diendapkan melalui lisis membran sel menggunakan garam konsentrasi tinggi aeperti kalium asetat atau ammonium asetat. Endapan dihilangkan melalui sentrifugasi, dan presipitasi alcohol dilakukan dengan tujuan agar DNA terlihat. Penggunaan metode ini untuk penghilangan senyawa pengotor seperti protein dan RNA dinilai kemungkinan kurang efisien. Kemurnian DNA yang diperoleh dengan metode ini sangat bervariasi.

4.    Pengikatan dengan silica⁽⁵⁾.

IV.        Metode

A.   Bahan dan Alat

Alat : 1. Bluetip

          2. Beaker Glass

          3. Ependrof

          4. Falcon Tube

          5. Mikropipet

          6. Pipet Volum

          7. Yellowtip

Bahan : 1. Darah Mamalia

               2. Te Buffer

                   - Tris – HCl 10 mm Ph 8,0

                   - EDTA 1 mm

               3. 10 X SE Buffer

                    - 750 mm NaCl 4,38 g

                    - 250 mm EDTA 9,30 g

                    - Aquadest add 9,30 ml

               4. 10 X Red Blood Cell Lysis Buffer=RBCLB Ph 7,4

                    - 1550 mm NH4Cl 8,2 g

                    - 100 mm KCO3 1,0 G

                                            - 10 mm EDTA 0,37 g

                    - Aquadest add 100 ml

              5. NaCl

              6. Kloroform

              7. Etanol 96 % dan 70 %

              8. Guanidin Isothiosianat 4M

B.   Cara Kerja

Diambil 2-3 ml darah, dimasukan dalam falcon tube

                                                                                   

Ditambahkkan 8-12 ml RBCLB lalu dihomogenkan, kemudian letakan pada es selama 20 menit

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit selama 10 menit

Dibuang suppernatan, ditambahkan 100 µl SE Buffer kedalam pellet, kocok perlahan hingga larut

Pindahkan larutan pada tabung Ependrof 1,5 ml

Ditambahkan 100 µl guanididn isothosianat 4M, diresuspensi

Ditambahkan 700 µl kloroform dan 400 µl NaCl

 

Dihomogenkan cairan terseebut secara hati-hati

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit

Dipindahkan lapisan atas kedalam tabung ependrof 1,5 ml menggunakan pipet

Ditambahkan 1 ml etanom absolute, campur perlahan dengan membolak-balikan tabung DNA

Benang DNA yang muncul diiambil dengan mikropipet 1 ml dan dipindahkan ketabung ependrof steril dan bersih

Apabila benang DNA tidak muncul, lakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit

Benang DNA yang diperoleh dicuci dengaan etanol 70 % sebanyak 500 µl

 

Dilakukan sentrifugasi campuran pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatant, keringkan pellet DNA pada suhu kamar selama 15 menit (atau dalam oven pada suhu 55⁰C selama 4-5 menit)

 

Tambahkan TE Buffer sebanyak 50-200 µl (tergantung dari banyaknya pellet yang dihasilkan

 

Disimpan larutan sampel pada suhu 20⁰C

V.        Hasil dan Pembahasan

a.    Hasil

-        Benang DNA tidak tampak

-       Setelah disentrifugasi terdapat pellet

b.    Pembahasan

Tujuan dari praktikum ini adalah pengambilan spesimen dan isolasi DNA mamalia. Metode-metode yang digunakan untuk isolasi DNA antara lain :

1.    Guanidin Isotiosianat

2.    Saturated Salts

3.    Fenol Kloroform

4.    Pemanasan Sederhana

5.    Reagen Kit

DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang bergabung membentuk nukleotida⁽⁶⁾. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain diinti sel. Prinsip isolasi DNA yaitu melisiskan darah, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA, pelarutan DNA, kemudian dihitung DNA yang diperoleh dan diihat apakah DNA yang didapat murni atau mengandunng zat lain.

Pada percobaan ini digunakan metode guanidine isotiosianat yang berfungsi untuk melisiskan membrane inti atau nucleus. Sampel darah yang diambil ditambahkan RBCLB (Red Blood Cell Lysis Buffer) untuk melisis sel darah merah (eritrosit), sampel darah yang telah ditambahkan dengan RBCLB dimasukan kedalam es untuk membantu melisiskan sel darah merah, selain itu juga untuk menghindari kontaminasi dan kemudian disentrifugasi untuk memisahkan supernatant dan erotrosit. Setelah disentrifugasi diambil bafikotnya yang terdiri dari pellet dan sel ditambahkan SE Buffer kedalam bufikot untuk melisiskan membrane sel, kemudian ditambahkan guanidine isotiosianat untuk melisiskan membrane inti, kloroform untuk membantu denaturasi dan presipitasi DNA, NaCl untuk menghilangkan kontaminan pada isolasi seperti polisakarida, setelah itu disentrifugasi untuk mengendapkan kontaminan dan ditambahkan etanol absolute (96%) untuk membantu pengendapan atau presipitasi DNA. Setelah didapatkan benang DNA ditambahkan etanol 70 % untuk pencucian DNA dan menghilangkan residu garam, ditambahkan TE Buffer untuk melarutkan kembali DNA dan menjaga kestabilan DNA selama penyimpanan.

Dari percobaan yang kami lakukan tidak benang DNA  nya tidak tampak sehingga disentrifugasi lagi untuk memperoleh pellet DNA. Hal ini disebabakan karena kemungkinan pada saat pengambilan bafikot, supernatannya masih tertinggal atau belum diambil semua untuk dibuang, sehingga mempengaruhi hasilnya.

VI.        Kesimpulan

Pada percobaan yang kami lakukan benang DNA tidak terlihat  karena mungkin pada saat pengambilan bafikot supernatannya masih tersisa atau belum diambil seluruhnya dan pada saat pengerjaan tidak dilakukan dengan hati-hati sehingga mempengaruhi hasilnya.

VII.        DaftarPustaka

1.    Yuwono, T., 2005, Biologi Molekular, Penerbit Erlangga, Jakarta, Hal 51.

2.    Marks, D., dkk, 1996, Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis, Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta, Hal 242.

3.    Arachchi, D., Wanigatunge, R., 2011, A Simple and Rapid DNA Extraction Methods for Cyanobacteria and Monocots, Institute of Fundamental Studies, Hantana Road, Kandy, Srilangka. Vol. 40, No.1 : 59

4.    Tan, Shiu Che., Yiap, Beow Chin., 2009, DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present, Journal of Biomedicine and Biotechnolog, Kuala Lumpur, Malaysia : 1

5.    Chomczynski, P., Sacchi, N., 2006, Single-step Method of RNA Isolation by Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction, Nature Prot, Vol.1, No.2 : 581-585

6.    Istanti, A., 1999, Biologi Sel, Biologi FMIPA UM, Malang.