By :
Karina Erlianti
Shinta Destiawan
Nurul Fitri Ramadhani
Arini Milati
Egie Andianty
Andika Wiratama
IDENTIFIKASI
MIKROBA DENGAN TEKNIK PENGECATAN
A.
TUJUAN
a.
Untuk mengetahui perbedaan bakteri Gram
positif dan Gram negatif
b.
Mengentahui teknik pewarnaan dan
pengecetan Giemsa
c.
Mengamati Plasmodium dan membedakan
bentuk shizon, tropozit, dan gamet dari masing-masing plasmodium
B.
DASAR TEORI
a. Identifikasi
Mikroba dengan Teknik Pengecatan
Mikroorganisme
sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya (1).
Mikroorganisme yang
ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat
sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu
teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (2).
Struktur di dalam
sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora.
Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap
panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut
disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini
menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila
diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora.
Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan
letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk
membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (3).
Dalam
taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram (Gram Stain),
yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke
dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang
relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang
lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada
dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang
terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan
penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan
spesies gram-positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri
gram negatif sering bersifat toksik (racun), dan membran bagian luar membantu
melindungi bakteri gram-negatfi patogen melawawn sistem pertahanan inangnya.
Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih resistern terhadap antibiotik
dibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar itu mengahalangi
masuknya obat-obatan (4).
Bakteri Gram
Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan
yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika diwarnai dengan pewarnaan Gram.
Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema pallidum, Vibrio Cholerae dan
Bacillus subtilis. Sedangkan Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang memiliki
dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tipis. Bakteri ini akan berwarna
merah muda atau merah, kila diwarnai dengan pewarnaan Gram. Contohnya
Propinibacterium acnes, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli (5).
Escherichia coli adalah bakteri berbentuk batang,
anaerob fakultatif (dapat melakukan fermentasi ketika tidak ada oksigen, dan
bisa melakukan respirasi selular secara aerob bila ada oksigen, Gram-negatif, dan non-spora. Bakteri
ini memfermentasi laktosa. Bakteri ini juga katalase positif, oksidase-negatif,
dan indol positif. Mereka bisa tumbuh pada kisaran suhu 7-46oC dan
dapat tumbuh pada aktivitas air minimum 0,95, Suhu optimum bagi Escherichia coli
adalah 37oC. Sel Escherichia coli memiliki diameter 0,5 µm dan
panjangnya 1,5 µm. Escherichia coli adalah Gram-negatif dan sel
prokariotik. Hal ini didasarkan pada keberadaan membran luar yang tidak bisa
mengikat saat pengecatan Gram dan tiadanya keberadaan nukleus (6)..
Staphylococcus aureus
(Staphylococcus
pyogenes) merupakan kokus Gram positif, berbentuk lonjong atau bulat,
tidak bergerak, tidak bersimpai dan tidak berspora. Tersusun dalam kelompok
seperti buah anggur. S. aureus bersifat anaerob dan tumbuh dengan baik
pada temperatur optimum 37oC dan pH 7,4. Pada perbiakan cair, S.aureus menyebabkan kekeruhan merata dan
memperlihatkan pertumbuhan khas berupa endapan di dasar tabung. S. aureus
merupakan salah satu kuman yang cukup kebal di antara organisme-organisme tak
berspora. Tahan dipanaskan pada 60oC selama 30 menit. Sumber lain mengatakan bahwa
temperatur optimum 30-37oC, range 6-48oC. Sedangkan pH
optimum pertumbuhannya 6-7, pH minimum pertumbuhan 4.2 dan maksimum 9.3 (7)
.
C.
Cara Kerja
a. Identifikasi
bakteri dengan teknik pengecatan gram
1. Pembuatan
preparat untuk pengecetan
Diambil
gelas objek yang bersih dan steril
↓
Dibebaskan
dari lemak dengan memanaskannya diatas nyala api spiritus dengan ose steril
↓
Diambil
sedikit satu koloni bakteri, diratakan pada gelas objek dan ditipiskan
↓
Ose sesudah
dipakai mengambil bakteri harus disterilkan kembali dengan cara dipanaskan
dibakar diatas api spiritus sampai membara dan disterilkan kembali sebelum
dipakai.
↓
Preparat
dikeringkan diatas nyala api spiritus sambil digoyangkan (jarak preparat sampai
api kira0kira 20cm) setelah kering preparat siap di cat.
2.
Cara melakukan pengecetan gram
Preparat
yang sudah siap dicat, digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. Kemudian cat
dibuang dan dicuci dengan air
↓
Preparat
digenangi dengan cat gram B selama 1 menit, warna oleh bakteri menjadi lebih
baik. Cat dibuang dan dicuci air.
↓
Preparat
ditetesi dengan cat gram C sampi warna cat dihilangkan selama 30 detik.
↓
Digenangi
dengan cat gram D selama 1 menit sebagai warna kontras. Preparat dicuci.
↓
Dikeringkan
diatas nyala api spiritus dan diperiksa dibawah mikroskop dengan menggunakan
perbesaran 100xobjektif
D.
Alat dan Bahan
Alat :
1.
Mikroskop
2.
Preparat
3.
Ose bulat
4.
Tabung reaksi
5.
Rak tabung
6.
Spiritus
Bahan :
1.
Bakteri S.aureus broth dan slant
2.
Bakteri E.coli broth dan slant
3.
Cat gram A-D
4.
NaCl 0.9%
5.
Oil imersi
E.
DATA dan HASIL
Gambar
S.aureus Broth
Media broth
bakteri berpencar, bentuk bulat, dan berwarna ungu kemerahan termasuk gram
positif
Gambar S.aureus Slant
Media slant
bakteri membentuk gumpalan atau koloni, bulat2 kecil, dan berwarna ungu
kemerahan, termasuk gram positif
F.
PEMBAHASAN
Pada
praktikum ini melakukan percobaan pewarnaan dan pengecatan gram yang bertujuan
dapat membedakan gram positif dan gram negatif pada S. aureus dan E.coli. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif
dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri
dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat
bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu,
pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai
dinding sel seperti Mycoplasma sp
Adapun zat-zat warna yang digunakan
dalam pewarnaan gram ini digolongkan menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna
basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh
zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain.
Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna
asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian
inti sel. Pewarnaan bakteri sendiri dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan
penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru
ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah
Proses pewarnaan gram, pertama harus
mensterilkan gelas obyek terlebih dengan alkohol dahulu ini bertujuan supaya
terbebas dari lemak dan debu yang masih menempel pada dinding gelas obyek
tersebut. Kemudian di beri aquades satu tetes pada permukaan gelas obyek.
Setelah itu bakteri di ambil dan diratakan di atas gelas obyek. Saat
pengambilan bakteri hanya sedikit yang di ambil karena akan sulit diratakan
apabila terlalu banyak maka bakteri akan tertimbun yang mana akan mengakibatnya
bakteri menjadi tidak tampak.
Setelah itu dikeringkan dan dilakukan
fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan
supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri
tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam
proses fiksasi yaitu bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena
nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet
dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering
(dengan cara dianginkan). Ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna
dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian
diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu kompleks antara
violet kristal dan iodin. Kemudian oleskan bakteri dan dicuci kembali dengan
air mengalir.
Pewarnaan selanjutnya dengan
menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering
dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop.
Setelah pemberian kristal violet pada
bakteri gram positif menunjukan warna
ungu. Karena bakteri gram positif mengandung protein. Sedangkan pada bakteri
negatif menunjukan warna merah karena mengandung lemak dengan presentasi yang
lebih tinggi dan mempunyai dinding selnya yang tipis
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel
dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan
pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol,
pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga
pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram
merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa
perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri
Gram negatif.
Perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif dapat
dikategorikan dengan ciri-cirinya, dimanabakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding
selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya
mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.
3. Lapisan kaku,
sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
4. Kurang rentan
terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak
begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi
yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten
terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap
alkali (1% KOH) lebih pekat.
9. Peka terhadap
streptomisin.
10. Toksin yang
dibentuk Endotoksin.
Sedangkan ciri-ciri bakteri gram positif
yaitu:
1. Struktur dinding
selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya
mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih
rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat
secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi
yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten
terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap
alkali (1% KOH) larut.
8. Tidak peka
terhadap streptomisin.
9. Toksin yang
dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Hasil pewarnaan gram bakteri positif
menunjukan adanya warna.
Kelebihan
dan kekurangan pengecatan gram
Kelebihan :
1. Pengecatan
gram penting sebagai pedomana awal untuk memutuskan terapi antibiotik,sebelum
tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan
bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif
mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antimikroba
2. Kadang-kdang
morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik
Kekurangan: Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme
dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair
dengan jumlah kecil mikroorganisme.
G.
KESIMPULAN
1. Bakteri gram
positif memiliki kandungan lemak yang ditandai warna ungu sedangkan gram
negatif memiiki kandungan lemak yang rendah yang ditandai dengan warna merah.
Bakteri S.aureus adalah gram positif, bakteri E.coli adalah gram negatif
2. Teknik
pengecatan yang baik dilakukan berdasarkan langkah yang benar, pengecatan
dilakukan dengn teliti tidak boleh sampai terjadi penukaran pengecatan karna
mempengaruhi hasil. Dan dapat mengetahui golongan atau jenis bakteri termasuk
gram positif atau gram negatif.
3. Pengamatan
bakteri gram positif (S.aureus) warna ungu, bentuk coccus, dan susunan seperti
buah anggur. Sedangkan gram negatif (E.coli) warna merah, bentuk batang.
H.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Lay, Bibiana W.,1994, Analisis mikroba di
laboratorium, PT. Raja Grafindo, Jakarta, hal. 13
2. Jawetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23.
Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC
3. Prescott, Harley, Klein’s. 2008. Microbiology 7th edition.
Boston : Published by McGraw-Hill
4. Campbell,Nell
A dan Jane B, Reace, 2003, Bilogi ed Kelima Jilid 2, Erlangga, Jakarta.
5. Aryulina,Diah
dan Choirul Muslim, 2004, Biologi SMA dan MA untuk kelas X, Penerbit Erlangga,
Jakarta
6.
Atlas, Ronald M. 1995. Principles of Microbiology.
St. Louis, MO: Mosby-Year Book.
7.
Bremer PJ, et.al. 2004. Staphylococcus aureus.
New Zealand: New Zealand Institute for Crop & Food Research Limited.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar